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News Center小鼠肝細胞分離是生物醫(yī)學研究領域的一項基本技術,對于肝臟疾病機制研究、藥物篩選和細胞治療等具有重要意義。然而,肝細胞分離過程中的純度和存活率是影響實驗結果的關鍵因素。本文將分享一些實用的分離技巧,旨在提高小鼠肝細胞的純度和存活率。
一、實驗前的準備工作
1.選擇合適的實驗小鼠:選用健康、適齡的小鼠,一般選擇8-12周齡的成年小鼠,以保障肝細胞的活力。
2.實驗材料準備:確保所有實驗器材無菌,包括手術器械、離心管、培養(yǎng)皿等。同時,準備好預冷的PBS緩沖液、酶消化液等試劑。
3.環(huán)境控制:實驗過程中,保持實驗室溫度在22-25℃,以減少細胞應激反應。
二、小鼠肝細胞分離步驟及技巧
1.麻醉與消毒:采用戊巴比妥鈉對小鼠進行麻醉,剃毛并消毒手術部位。
2.開腹與肝臟取材:沿小鼠腹部中線切開,暴露肝臟,用無菌眼科剪剪下肝臟,放入預冷的PBS緩沖液中。
3.肝細胞消化:將肝臟剪成小塊,加入含有酶消化液的培養(yǎng)皿中,置于37℃水浴鍋中振蕩消化。
以下為提高純度和存活率的技巧:
a.酶濃度優(yōu)化:根據(jù)肝臟的軟硬程度,調整酶消化液的濃度,避免消化過度或不足。
b.消化時間控制:密切觀察肝臟組織的變化,一般在20-30分鐘內完成消化,避免時間過長導致細胞損傷。
c.輕柔操作:在消化過程中,輕柔搖動培養(yǎng)皿,避免劇烈振蕩造成細胞損傷。
4.細胞過濾與洗滌:消化結束后,用200目細胞篩過濾,去除未消化的組織塊。然后,用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞,去除殘留的酶和雜質。
三、細胞純化與存活率檢測
1.差速離心法:將過濾后的細胞懸液低速離心(500rpm)去除紅細胞,再進行高速離心(1200rpm)獲得純凈的肝細胞。
2.臺盼藍染色法:對分離得到的肝細胞進行臺盼藍染色,計算活細胞比例,評估細胞存活率。
四、提高細胞純度和存活率的關鍵點
1.無菌操作:全程嚴格無菌操作,防止細菌、真菌污染。
2.預冷處理:所有試劑和器材均需預冷,降低細胞應激反應。
3.短時間內完成操作:從肝臟取材到細胞分離,盡量在短時間內完成,減少細胞在體外環(huán)境中的損傷。
小鼠肝細胞分離技術在生物醫(yī)學研究中具有重要價值。通過掌握上述技巧,我們可以在一定程度上提高肝細胞的純度和存活率,為后續(xù)實驗奠定堅實基礎。在實際操作過程中,還需不斷總結經驗,優(yōu)化實驗方案,以獲得更高質量的肝細胞。